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脂质纳米颗粒在过去的二十年中引起了行业极大的兴趣，自年Doxil首次临床获批以来，取得了巨大的临床成功。与此同时，脂质纳米颗粒在递送核酸药物方面也显示出巨大的潜力，两种RNA疗法和mRNACOVID-19疫苗的获批证明了这一点。文章首先对脂质体、固体脂质纳米颗粒、纳米结构脂质载体等脂质纳米颗粒进行了综述，并介绍了它们的制备方法。然后简要介绍了脂质纳米颗粒的表征，重点介绍了脂质纳米颗粒在包封和递送疏水性药物、亲水性药物以及RNA等方面的应用。最后，文章总结了脂质纳米颗粒在克服不同给药挑战方面的各种应用，包括穿过血脑屏障、靶向给药和各种给药途径。脂质纳米颗粒作为药物递送系统提供了许多有吸引力的优点，如良好的生物相容性、易于制备、放大可行性、无*和靶向给药，而目前在药物传递方面的挑战需要未来对结构-功能相关性、大规模生产、以及靶向递送的深入研究，以实现脂质纳米颗粒在未来更广泛的临床和药物应用的全部潜力。
脂质纳米颗粒的表征
LNP的正确表征不仅对于研究LNP的合成至关重要，对于控制其质量、以满足各种应用的要求亦是如此。LNP的一些重要特性需要仔细表征，包括粒径和多分散系数（PDI）、zeta电位(ZP)、表面形态、包封效率（EE）、药物释放、结晶度和纳米颗粒稳定性。
粒径、ZP和表面形态
粒径是纳米颗粒药物递送应用的关键参数。LNP的平均粒径通常在-nm之间，粒径在10-~nm之间的LNP对于通过静脉内(IV)注射以进行系统性给药是理想的选择。此外，PDI表明粒径分布的程度，范围为0-1，PDI小于0.2通常被认为粒径分布较窄，而大多数研究将PDI值小于0.3作为上限。通常，粒径和PDI可以通过动态光散射(DLS)来确定，其测量由于颗粒运动引起的波动光的强度差异。
ZP是指由ZP分析仪检测的颗粒的表面电荷。它可用于通过确定排斥力的程度来指示配制的胶体分散体的稳定性。高排斥力可防止颗粒聚集。通常，ZP高于+30mV或低于-30mV被认为足以相互排斥并保持静电稳定。应该注意的是，含有非离子表面活性剂（如多羟基表面活性剂）的LNP配方往往具有较低的ZP值。同时，据报道，油含量的增加会提高LNP的ZP值。但对于系统性药物递送，建议选择接近中性电荷。过强的电荷需要通过聚乙二醇修饰或其它一些表面改性（例如用Tween80等非离子表面活性剂覆盖LNP）来屏蔽。
扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)经常被用于确定颗粒尺寸以及观察颗粒表面形态。SEM和TEM分别通过从颗粒表面和颗粒内部结构传输的电子提供形态信息。相比之下，AFM允许获得LNP的3D特性。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）是一种检测被测样品吸收或透射的红外辐射，并将信号转换成红外光谱的技术。FTIR主要用于通过比较载药LNP、纯LNP和纯药物的FTIR光谱来验证药物在LNP中的成功包封以及表征LNP的化学结构。
药物包封率
药物EE是评价药物包封制备方法的重要指标。它使用以下公式定义
为了确定包封在纳米颗粒中的药物量，通常使用UV-Vis光谱法或高效液相色谱法(HPLC)。透析膜可用于去除未包封的药物。另一种选择是通过超速离心分离包封的药物和游离药物。例如，以35,g离心40min可将药物包封的纳米颗粒离心下来，然后收集上清液，以确定溶液中残留的药物。EE的测量主要有两种方法，包括直接法和间接法。直接法直接计算纳米颗粒中包封的药物量，而间接法测量上清液中未被包封的药物量，然后计算EE。通常，直接法适用于测定亲脂性药物的EE，而后者适用于亲水性药物。
EE对于了解成功包封在载体中的药物百分比至关重要。较高的EE对药物递送应用来说是基本要求。影响EE的几个关键因素包括脂质材料的类型、组成和结晶度，以及药物在有机相和水相中的溶解度。通常，LNP中药物的EE预计会高于70%。与SLN相比，NLC通常由于存在液体脂质而具有更高的EE。制备过程中形成的不完美核为药物载入提供了更大的空间，从而提高了药物EE。然而，与疏水性药物相比，亲水性药物通常具有较低的EE，因为它在外部水相中具有高溶解度。
药物释放研究
通常，LNP的药物释放主要受两个过程控制，即生物降解和扩散。体外研究对于预测载药LNP的体内行为非常有用。模拟体内药物释放的体外药物释放研究通常在磷酸盐缓冲液(PBS)或模拟体液中进行，使用具有并排扩散池的生物或人工膜状反向透析囊、超速离心、透析袋、超滤离心和超滤。然后使用UV分光光度计或HPLC分析药物释放曲线。许多因素会影响LNP的体外释放曲线，包括载药量、药物定位、粒径、粒径分布、结晶度、脂质含量、释放介质的类型、形态、应用的表面活性剂以及制备技术。
结晶度
确定LNP成分的结晶度非常重要，因为脂质和包封的药物在储存过程中可能会发生多晶型转变，导致药物排出和不稳定性。脂质结晶度也强烈影响药物载入和药物释放。差示扫描量热法（DSC）和X射线衍射(XRD)常用于研究脂质结晶的结构、含量和大小。DSC测量被测样品在升温和降温过程中的热容量变化，并在不同的相变温度观察峰值。DSC是一种通过焓变确定LNP结晶度的简单、快速和直观的方法。然而，DSC的主要缺点是它是一种破坏性方法，因为它需要加热。非破坏性XRD通过测量通过测试样品散射的X射线的强度和角度来指示晶体结构。然而，XRD的利用存在局限性，因为它测量的是粉末样品，这意味着含NP的悬浮液需要经过干燥，并且在此过程中可能会发生多晶型转变。通常，可以将DSC和XRD结合起来分析LNP的原子间距离，从而了解LNP的组成。固体和液体脂质成分的存在有利于促进更多的治疗分子载入并减少多态性转变过程中的药物泄漏。据报道，液体脂质含量的增加可以减轻NLC的结晶度，而在SLN的情况下会观察到缓慢的药物释放，因为SLN的结晶度相对较高。
LNP稳定性
稳定LNP的开发仍处于早期发展阶段，对开发含有LNP的商业化产品提出了一系列挑战。LNP在下一代治疗性RNA疫苗和治疗药物中的潜力将推动稳定水性制剂的开发。制剂治疗性蛋白质（包括单克隆抗体）的经验有助于预测LNP制剂中可能出现的问题，包括LNP成分的化学稳定性、LNP的物理稳定性（崩解、聚集和表面吸附），以及LNP中RNA的稳定性。成功的治疗性蛋白质产品作为液体制剂需在5±2℃下可稳定保存超过18个月。证明产品“坚固性”的稳定性测试已得到了很好的发展，包括加速稳定性（例如，40℃持续4周）、冻融循环（3或4个循环）和振动测试。这些模拟了冷链中通常会发生的可能导致产品问题的事件。在水溶液中对合成纳米颗粒的研究表明，纳米颗粒和共溶质之间的许多相互作用是可以预测的，盐会影响纳米颗粒溶解度，其遵循FranzHofmeister在年建立的系列，根据纳米颗粒的疏水性而表现出不同的行为。已发表的LNP稳定性研究已成功使用DLS研究平均粒径、PDI和ZP之间的关系以及LNP在溶液中的存储时间。
包封的不同药物类型
水不溶性药物
大约40%已获批的药物和90%的在研药物是疏水性的，因此开发疏水性药物的递送工具引起了行业极大的兴趣。LNP已广泛用于疏水性药物递送。大量疏水性药物已成功包封在LNP中，以优化生物利用度和控释。例如，多西他赛(DTX)是一种非常有效的抗肿瘤和抗血管生成剂。然而，由于水溶性差、细胞*性高，其临床应用受到限制。为了解决这些问题，使用CompritolATO作为脂质材料、PluronicF和Span80作为稳定剂制备了载DTX的LNP。LNP的粒径为nm，PDI为0.2，DTX的EE为86%，DL为2%，并且观察到了控释曲线。重要的是，最终载DTX的LNP在天内保持稳定。同样，Das等人使用乳化-超声方法，以PrecirolATO5和CompritolATO制备了具有75%EE的载维甲酸LNP。载维甲酸LNP在4℃下可保持稳定3个月。此外，载IR-碘化物c(RGDyK)偶联LNP被设计用于近红外(NIR)成像引导的光热疗法，其使用溶剂扩散法，实现了高EE(85.34%)，并在小鼠实验中观察到高细胞*性和低副作用。此外，已制造LNP来包封既不溶于水也不溶于油的药物，例如顺铂(CDDP)。此类药物溶解度差，对药物递送系统的设计和开发提出了挑战。Gup等人成功合成了脂质包被的CDDP纳米颗粒，其EE高达80.8%。
水溶性药物
由于亲水性药物的高水溶性，包封和精确控制其释放具有不小的挑战性，因此难以避免药物向水相泄漏。LNP已被用作捕获和递送亲水性药物的潜在载体。微乳液和双乳液法已广泛用于亲水性药物包封。已经开发了一种微乳液方法来封装巴龙霉素，这是一种用于治疗寄生虫感染的广谱抗菌剂。它是一种高极性有机分子，水溶性非常高，为79.9mg/mL。使用微乳液法，在硬脂酸纳米颗粒中巴龙霉素达到了最大EE(41.65%)，药物与脂质的比率为4。简单来讲，在85°C下将含有巴龙霉素的水相添加到硬脂酸和表面活性剂的透明混合物中，并保持搅拌。然后将形成的微乳液以18,rpm均质20分钟，以产生纳米乳液。之后，在双蒸水（2-5℃）中冷却后，得到含有巴龙霉素的硬脂酸纳米颗粒。
双乳液法也常用于包封亲水性药物。W/O/W双乳液的独特结构和性能能够形成亲水性载药LNP。例如，一种壳聚糖包被的胰岛素包封LNP被开发用于胰岛素的口服给药。将含胰岛素的水相加入到有机相中的Witepsol85E中，然后均质，以形成初级W/O乳液，之后将其倒入2%吐温80溶液中，再次均质，形成次级W/O/W双乳液。最后，在磁力搅拌下将双乳液倒入含有2%吐温80的0.5%w/v壳聚糖溶液中，直至溶剂完全去除，形成壳聚糖包被的胰岛素包封LNP。但双乳液法生产的LNP的EE通常不是很高，因为亲水分子提前释放到外部水相中。
LNP也被开发用于制造基于肽的肿瘤疫苗。蜂*肽是一种源自欧洲细小*液的阳离子亲水性肽。它显示具有广泛的免疫调节和抗肿瘤作用，但其药物应用受到其正电荷的限制，导致细胞*性、快速清除和非特异性生物分布。与游离蜂*肽相比，Yu等人设计了一种α-蜂*肽-LNP。由于成功屏蔽了其正电荷，载蜂*肽的LNP使免疫反应强度提高了3.6倍，而细胞*性更小。LNP也被制造用来包封亲水性抗生素，以用于口服给药。使用冷高压均质法制备的含有硫酸链霉素(STRS)的LNP，获得30%DL和51.17±0.95%EE。合成的载STRSLNP能够通过显著增加的细胞内摄取和受控释放，克服胃屏障。此外，与游离药物相比，在体内研究中实现了更高的生物利用度（高1.6-7倍）。
RNA
在过去的二十年里，已经开发出各种基因疗法来治疗包括肿瘤、获得性免疫缺陷综合征(AID)和帕金森在内的多种疾病。自从最近批准了两种RNA药物：Patisiran（年）和Givosiran（年），人们对开发临床RNA疗法产生了极大的兴趣。Patisiran是siRNA的LNP制剂，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性。RNA疗法在给药方面面临许多挑战。RNA分子通常不稳定，容易被核酸酶降解并被免疫系统迅速清除。此外，RNA分子的负电荷使它们无法被动地穿过细胞膜。而以受控方式释放RNA分子靶向细胞或器官的潜力仍然是一个巨大的挑战。因此，RNA分子的递送载体对于促进它们进入细胞质至关重要。基于病*和非病*的载体都已开发用于RNA递送。基于病*的载体主要包括逆转录病*载体、慢病*载体、腺病*载体和痘病*载体。通常，基于病*的载体通过病*感染途径侵入细胞，因此它们具有基因转导效率高、位点靶向基因递送、免疫反应增强等优点，但也存在致突变和致癌顾虑、高产量成本以及低包装容量等缺点。与病*载体相比，阳离子聚合物、脂质和基于脂质的材料等非病*载体表现出了更高的灵活性和更好的安全性。
可电离阳离子脂质的开发使得实现RNA细胞质递送成为可能。可电离阳离子脂质在酸性环境中带正电，但在生理pH值下保持中性。Patisiran制剂（Onpattro，AlnylamPharmaceuticals）于年获批，是第一个具有代表性的可电离阳离子脂质制剂RNA药物。它包含一种合成的可电离阳离子脂质(DLin-MC3-DMA)。与永久阳离子脂质相比，可电离的阳离子脂质不仅有利于在酸性pH下与带负电荷的RNA进行静电相互作用，而且有利于诱导内体逃逸和降低细胞*性。换句话说，可电离LNP不太容易被网状内皮系统识别然后去除。进入核内体后，可电离LNP在核内体的酸性环境（pH5-6）中带正电，并自发地与阴离子核内脂质融合，从而将RNA载荷释放到细胞质中。当可电离脂质的pKa值介于6.2和6.5之间时，通过IV给药，载RNA的LNP可以实现靶向肝脏的最佳效率。另一种包封RNA的LNP被设计用于递送CRISPR-Cas9基因，其已被证实能够永久性破坏肿瘤基因。使用NanoAssemblr微流控混合装置制备CRISPER-LNP，使用可离子化脂质、DSPC、胆固醇DMG-PEG和DSPE-PEG，摩尔比为50:10.5:38:1.4:0.1，达到70%的体积基因编辑效率，50%的肿瘤细胞生长抑制，且存活率大幅度提高。
此外，两种COVID-19疫苗（BioNTech/Pfizer和Moderna）也是mRNA的LNP制剂。辉瑞和Moderna疫苗均由可电离的阳离子脂质、聚乙二醇化脂质、中性脂质和胆固醇组成，但摩尔脂质比相对不同。辉瑞疫苗由[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-)、2-[(聚乙二醇)-2]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-)、DSPC和胆固醇组成，摩尔脂质比(%)为46.3:9.4:42.7:1.6。Moderna疫苗含有十七烷-9-基8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸酯(SM-)、1-单甲氧基聚乙二醇-2,3-二肉豆蔻基甘油与平均分子量2聚乙二醇(PEG2-DMG)、DSPC和胆固醇，摩尔比为50:10:38.5:1.5。
通常，基于脂质的RNA递送系统由四种主要成分组成，包括可电离的阳离子脂质、结构脂质、胆固醇和聚乙二醇脂。可电离的阳离子脂质主要位于LNP的内核，而结构辅助脂质形成LNP的外层。产生这种LNP的常用方法是将乙醇-脂质溶液与含有带负电荷的RNA的酸性水溶液快速混合，然后在中性缓冲液中透析。许多因素会影响LNP的形成，包括脂质成分的比例、乙醇溶液与水溶液的比例以及混合条件。
交错的人字形微混合器可用于优化混合。总流速(TFR)和FRR是影响混合的两个重要参数，从而影响LNP的形成。无论阳离子脂质的类型如何，小混合速率会形成较大的颗粒，而较高的流速会产生较小的颗粒。缓冲液和脂质含量是影响LNP大小和稳定性的另外两个重要因素。为了更好地了解LNP的形成，最近的一项研究调查了载siRNA的LNP的形成机制，并发现了在pH中和时发生的融合过程。当LNP在酸性条件下合成时，它们很小，但在pH7.4的透析过程中融合成较大的电子致密颗粒（下图）。
在pH中和过程中融合导致LNP的形态变化。A)LNP在pH4下制备并透析到pH4缓冲液（左）或透析到PBSpH7.4（右）。B)LNP在pH4和pH7.4下的粒径。
原文：L.Xu,X.Wang,G.Yang,etal.,LipidNanoparticlesforDrugDelivery.Adv.NanoBiomedRes.,2,2109.
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