纲要：β-石竹烯是一种双环倍半萜，要紧用做食物和打扮操行业的香料。大肠杆菌做为化学能异养微生物，可经过有氧呼吸形成洪量的乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A是总共萜类生物合成中罕见的前体物资。是以，大肠杆菌有或许成为临盆萜类化合物的细胞工场。采纳生物消息学办法对香烟基因组施行剖析，发觉了一个新的β-石竹烯合酶基因（TPS7）。发觉来自香烟的一种新的倍半萜合酶TPS7能够高效地临盆β-石竹烯。基于此，建立了一种工程大肠杆菌，以形成比夙昔的研讨高很多的β-石竹烯浓度。在发酵流程中，做家视察到β-石竹烯偏向于在细胞内堆集，最后会影响工程大肠杆菌的活性。是以，做家经过代谢调治和原位讨取发酵办理了这个题目。
杂志名：BiotechnologyforBiofuelsandBioproducts（二区7.7）出书日期.4.15
英文题目：Highlyefficientbiosynthesisofβ-caryophyllenewithanewsesquiterpenesynthasefromtobacco
做家：TaoCheng,KaiZhang,JingGuo,QingYang,YitingLi*,MoXianRubingZhang*
单元：华夏科学院青岛生物动力与流程手艺研讨所华夏科学院生物基材料中心实践室
实质：萜烯是果然界中最大的次级代谢产品，β-石竹烯是一种双环倍半萜，具备三种构象：α-、β-和γ-。个中，β-石竹烯的含量在果然界中最高，通罕用做香料或其余更昂贵香料的前体，以及一种潜在的飞机燃料。总共倍半萜的生物合成依赖于法尼基二磷酸(FPP)的不异前体，它能够经过甲羟戊酸(MVA)道路或甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)道路形成。FPP能够经过倍半萜合酶直接转折为倍半萜（图1）
图1将异源MVA道路引入大肠杆菌以形成β-石竹烯
NtTPS7是凭借香烟基因序列，以香烟cDNA为模板，经过PCR扩增得到的。凭借NCBIBLAST的成效，香烟TPS7的氨基酸序列与各类倍半萜合酶的序列具备高度类似性。如图所示（图2A和3），退化树显示TPS7和β-石竹烯合酶比其余萜烯合酶具备更亲密的退化相干。
图2卵白质和基因序列的生物消息学剖析
做家将TPS7在大肠杆菌中的表白和表征，为了肯定TPS7可否在大肠杆菌中寻常表白，将该基因克隆到原核表白载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-tps7，成效这讲明没有暗码子优化的TPS7能够在大肠杆菌中以可溶样子胜利表白。
图3经过GC-MS对产品施行剖析和判定
接下来做家在工程大肠杆菌中过表白外源MVA道路以提升β-石竹烯的产量，成效异源MVA道路被引入大肠杆菌，以增进前体IPP和DMAPP的形成。经摇瓶教育弧线剖析，成效讲明在大肠杆菌能有用提升β-石竹烯的效价，并对β-石竹烯生物合成道路施行了优化。做家进一步研讨了β-石竹烯的细胞内或细胞外散布。为了研讨β-石竹烯在摇瓶中的散布，向导48小时后，将教育液离心，细胞和上清液离别用乙酸乙酯讨取，研讨讲明，β-石竹烯要紧在细胞内堆集。为了视察细胞状态跟着细胞内产品的堆集而产生的变动，在发酵流程中的各个点搜罗样本并运用透射电子显微镜（TEM）施行研讨（图6），发觉或许由于β-石竹烯在细胞内的太甚堆集，对细胞形成损伤，最后影响β-石竹烯的形成。
图4发酵流程中大肠杆菌的TEM视察
大大都单萜或倍半萜具备蒸发性并渗透到细胞外。要是产品没有分泌或仅分泌量不够，则能够欺诈原位讨取发酵来增进或启动由于细胞透化而致使的产品释放。β-石竹烯极性弱，蒸发性强，或许是产品在细胞内堆集并洪量逸出的起因。是以，做家采纳原位讨取发酵法，即在发酵液中介入有机溶剂施行原位讨取，用于讨取产品并保管产品溢出物。在此根本上，研讨了有机溶剂正十二烷、辛烷、庚烷和肉豆蔻酸异丙酯对β-石竹烯临盆和工程化CAR2细胞成长的影响。论断与议论：在这项研讨中，做家从香烟中发觉了一种具备高合成活性的新式β-石竹烯合酶。基于此，做家建立了能够高效临盆β-石竹烯的工程大肠杆菌CAR2菌株。经过对工程菌施行补料分批发酵和两相发酵，基于TPS7的人为合成道路以葡萄糖为碳源，可临盆mg/L的β-石竹烯，是现在生物合成流程中产量最高的。这一发觉讲明，该工程菌株具备庞大的产业临盆β-石竹烯的潜力。
供稿
(YCY)
编纂
(ZLQ)
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