SDRSensorDishReader氧 [复制链接]

最近对肠道炎症的研究表明，粘膜代谢会影响疾病结果。肠道炎症伴随着中性粒细胞（多形核白细胞=PMN）的积累。在这里，我们研究了迁移中性粒细胞对周围黏膜O2代谢的影响。在OxoDishes中使用SDRSensorDishReader进行细胞间串扰实验中的氧气监测。我们的研究结果表明，中性粒细胞如何迅速消耗局部分子氧，以至于接近的上皮细胞稳定了HIF（缺氧诱导因子）转录机制。此外，我们展示了这种局部O2消耗如何对炎症消退至关重要。

图1：实验装置示意图：(A)直接迁移模型：T84IECs生长在可渗透支架的底部。在底室中用fMLF建立趋化梯度。PMN被应用于顶部室并允许轮回。(B)间接迁移模型：像直接模型一样进行迁移，将无细胞上清液转移到幼稚T84单层。

中性粒细胞迁移到感染或损伤部位是身体自身防御所必需的。然而，肠道炎症期间PMN的积累可导致慢性炎症状态。PMN对受感染组织的浸润伴随着能量需求过程，例如迁移、吞噬作用和NADPH氧化酶爆发的产生，这些过程被认为会在炎症期间引起组织中的代谢变化。在这种情况下，PMN可能对周围细胞产生重要影响，但对于这些变化如何影响组织功能和疾病结果仍然知之甚少。在这些实验中，我们分析了PMN如何通过消耗局部分子氧来塑造组织微环境，以及这是否会影响细胞的转录谱。我们开发了一个实验装置来分析直接和间接模型中的细胞间串扰（图1）。为了监测激活的PMN的耗氧量，我们应用了PreSens的SDRSensorDishReader和24孔OxoDishes、集成氧传感器的多培养皿。在我们的实验中，使用SDR进行在线测量是一个很大的优势，因为它可以进行高通量分析。使用这个模型，我们能够展示激活的PMN如何迅速消耗局部分子氧以及这如何影响周围的上皮细胞。体内测试（此处未描述，参见[1]）进一步揭示了这种局部O带有集成氧传感器的多盘。在我们的实验中，使用SDR进行在线测量是一个很大的优势，因为它可以进行高通量分析。使用这个模型，我们能够展示激活的PMN如何迅速消耗局部分子氧以及这如何影响周围的上皮细胞。体内测试（此处未描述，参见[1]）进一步揭示了这种局部O带有集成氧传感器的多盘。在我们的实验中，使用SDR进行在线测量是一个很大的优势，因为它可以进行高通量分析。使用这个模型，我们能够展示激活的PMN如何迅速消耗局部分子氧以及这如何影响周围的上皮细胞。体内测试（此处未描述，参见[1]）进一步揭示了这种局部O2消耗有助于有效的粘膜保护和炎症消退。

图2：实验装置示意图：(A)共培养：PMN通过允许可溶性相互作用的过滤器与IEC物理分离。(B)使用SDR监测氧气：PMN通过Transwell过滤器与O2传感器物理分离-集成在OxoDish的每个孔的底部。

材料与方法

在直接迁移、间接迁移、共培养或使用SDR系统的实时氧气监测实验中检查中性粒细胞。对于直接迁移，T84肠上皮细胞(IEC)生长在胶原蛋白涂层的Transwell可渗透支持物（5.0m孔；康宁）的底部。中性粒细胞(1x)被应用于顶室，而在底室中加入趋化剂（1mfMLF=N-甲酰基-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸inHBSS=HanksBalancedSaltSolution），并允许中性粒细胞轮回（图1A)。在间接模型中，如前所述，收集来自直接迁移的条件上清液。通过离心（xg10分钟）使上清液澄清，然后应用于初始T84单层（图1B）。在共培养模型中，上皮细胞在24孔板（图2A）中培养，PMN悬浮在T84细胞上方的可渗透支撑物（0.4m孔；Corning）上，防止PMN和IEC之间的物理相互作用。使用24孔OxoDishes在常氧环境中的SDRSensorDish读取器(PreSens)上进行实时氧气监测。OxoDishes与含有fMLF或PMA（醋酸佛波醇肉豆蔻酸酯=肿瘤促进剂）的HBSS+或HBSS+预平衡。对于患者PMN，使用fMLF，对于小鼠PMN，使用PMA作为趋化剂。transwell过滤器将PMN与传感器分离（图2B）。搅拌整个系统以破坏Transwell过滤器下方未搅拌的液体。从健康志愿者的全静脉血或小鼠骨髓衍生的PMN中新鲜分离的中性粒细胞应用于过滤器。野生型(C57BL/6)小鼠和CGD(Nox2搅拌整个系统以破坏Transwell过滤器下方未搅拌的液体。从健康志愿者的全静脉血或小鼠骨髓衍生的PMN中新鲜分离的中性粒细胞应用于过滤器。野生型(C57BL/6)小鼠和CGD(Nox2搅拌整个系统以破坏Transwell过滤器下方未搅拌的液体。从健康志愿者的全静脉血或小鼠骨髓衍生的PMN中新鲜分离的中性粒细胞应用于过滤器。野生型(C57BL/6)小鼠和CGD(Nox2-/-)小鼠(JacksonLaboratories)用SDR进行了检查。CGD小鼠在表型上表现出人类慢性肉芽肿病(CGD)的症状，因为它们在PMN中缺乏功能性NADPH氧化酶，导致PMN呼吸爆发活性不足。如[1]中所述进行微阵列和分析。

图3：患者血液中PMN的O2消耗量：(A)利用图2中的实验设置从SDR软件获得的原始数据证明了CGD小鼠骨髓中PMN的O2消耗量。红色框表示用于分析的数据。(B)n=3实验的数据在MicrosoftExcel中针对大气压力进行了校正，并在GraphpadPrism中绘制。

PMN对微环境的影响

我们最初的实验集中在PMN迁移对肠上皮细胞转录谱的影响。因此，我们对直接和间接迁移模型进行了90分钟的平行实验，2小时后收获RNA，并通过微阵列分析转录谱。直接模型中的分析主要揭示了PMN特异性基因，这是由不完全迁移的中性粒细胞污染单层引起的。间接模型的分析表明，由于轮回过程中释放的因素而受到调节的基因存在。可以确定在两种模型中响应PMN诱导的许多缺氧调节基因。由于这些发现，我们想要测量活化PMN的耗氧量并确定PMN耗氧量对IEC转录谱的影响。我们使用了24孔OxoDishes，其中PMN悬浮在氧传感器上方。测量清楚地显示了PMN如何迅速耗尽所有可用的O2分钟内取决于细胞数量和激活因子。为了确保这种O2消耗足以使上皮细胞接近感觉缺氧，我们在存在缺氧依赖性加合物形成化合物（哌莫硝唑-HCl）染料的情况下，对悬浮在T84肠上皮细胞上方0.4m孔Transwell中的PMN进行共培养并用fMLF激活。0分钟和60分钟后，用Hypoxyprobe-1抗体(Hypoxyprobe)固定细胞并定位缺氧加合物。核提取物显示，PMN活化诱导HIF在暴露3和6小时时稳定。进一步研究PMN耗氧机制和PMN呼吸爆发在O2中的贡献耗尽后，我们从野生型C57BL/6和CGD小鼠中采集骨髓PMN，并将中性粒细胞在有或没有DPI（二苯碘鎓=NADPH氧化酶抑制剂）的情况下在冰上孵育15分钟。然后我们使用SDR系统监测PMN的O2消耗量。没有DPI的野生型小鼠的活化PMN再次迅速耗尽所有可用的氧气，而在存在DPI的情况下，野生型细胞的耗氧量被消除。在存在或不存在DPI的情况下，CGD小鼠的PMN几乎不消耗任何氧气，无论是否用PMA激活。综合我们在体外测试期间收集的所有数据，结果表明PMN通过NADPH氧化酶爆发消耗了足够的O2，附近的上皮细胞能够感知缺氧，并成为转录印记。

结论

我们使用的实验装置证明最适合研究细胞间串扰，也可以应用于其他细胞类型模型。使用SDRSensorDishReader的实时测量允许通过连续氧气测量进行高通量分析，并对PMN耗氧率提供出色的洞察力。这些结果从根本上促成了我们的发现，即上皮HIF稳定以响应PMN的快速O2消耗对于许多保护基因的转录诱导至关重要。进一步的小鼠体内试验表明，PMN的局部O2消耗对于炎症消退是至关重要的[1]。我们的研究结果为炎症性黏膜疾病的治疗选择提供了重要的见解。